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在世界饮食文化中，鲜味是5种传统味觉之一，也是理论界最后一种承认的味道。鲜味以其特殊的味觉感受而备受人们喜爱，并且由于鲜味与其他滋味有良好的协同性，因此成为评价美食的重要指标之一。人们发现在肽、有机酸、核苷酸、氨基酸等物质中均有鲜味，在这些物质中，鲜味肽具有良好生理活性和风味活性，因此许多学者对其进行研究。近年来，对食用菌原料鲜味物质的研究较多。食用菌不仅味道鲜美，而且营养价值高，对于高血压、心脑血管疾病等都有预防作用，深受广大消费者喜爱。
南京财经大学食品科学与工程学院，江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心的蒋希希、裴 斐、胡秋辉*等以草菇为原料，采用超滤、凝胶过滤色谱、RP-HPLC从草菇水提物中分离纯化出鲜味肽，利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）从中鉴定出鲜味肽的序列。并通过固相化学合成法反相合成的纯肽对草菇鲜味肽的呈味特性加以分析，旨在为草菇鲜味调味品的开发提供一定的理论依据，以提升草菇附加值。
1、超滤和凝胶色谱分离纯化草菇中的肽
如图1所示，超滤组分A-I经凝胶过滤色谱分离后，在保留时间60～260 min内，共获得F1、F2、F3和F4。分别收集各组分，冷冻干燥后进行电子舌分析及感官分析。
如图2A所示，电子舌分析表明这4种组分的味道特征相似，鲜味、咸味和甜味相对较强，苦味和酸味相对较弱。与其他组分相比，将A-I组分与凝胶色谱分离组分进行滋味稀释分析。结果如图2B所示，A-I组分的滋味稀释因子为92，而凝胶色谱分离组分中，F1组分的滋味稀释分析值为34，是层析组分中最高的，说明F1对整体的鲜味影响最大。在分离纯化鲜味肽的过程中，超滤只是一个压力驱动的膜分离过程，在这种过程中很难分离出分子质量精确的多肽，所以进一步采用凝胶分离进行纯化，以获得更精确的组分。
2、RP-HPLC分离纯化草菇中的肽
如图3所示，F1组分经RP-HPLC分离后共得到4个组分，分别为F1-a、F1-b、F1-c和F1-d，相应的出峰时间为3.563、4.021、4.430、5.825 min，RP-HPLC根据分子的疏水性强弱进而将物质洗脱分离，出峰时间越短，则亲水性越强，F1-a的出峰时间最短，说明其亲水性较强，而亲性强弱与氨基酸性质有关，多数的甜鲜味氨基酸如丝氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）、苏氨酸（Thr）以及天冬氨酸（Asp）等为亲水性氨基酸，多数的苦味氨基酸如苯丙氨酸（Phe）、缬氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）以及异亮氨酸（Ile）等为疏水性氨基酸，因此，F1-a可能含有较多的甜鲜味的亲水性氨基酸。
如图4A所示，经RP-HPLC分离的4组分鲜味特征强烈，在所有口味中占主导作用，苦味和咸味相对较弱。4组分中F1-a鲜味效果最佳，其次为F1-d，而F1-b和F1-c的鲜味值较低，呈鲜效果较差。如图4B所示，所有样品在PCA图上无重叠，表明电子舌可以有效区分RP-HPLC分离组分的滋味。与F1-b、F1-c和F1-d相比，经过纯化的F1-a滋味更接近于味精和F1组分，说明F1-a组分在草菇水解液中的鲜味最强，更接近于草菇的原始滋味，即草菇鲜味肽，结合图3表明F1-a可能含有较多的甜鲜味的亲水性氨基酸，因此选择F1-a组分进行质谱分析进一步解析鲜味肽结构。
3、UPLC-Q-TOF-MS分离鉴定草菇中的肽
如图5显示，在m/z 376.07、728.48、745.45、408.32处质谱丰度较强，对这些质谱峰进行碰撞诱导裂解，并进一步对照Peaks Studio系统对肽序列进行自动数据检索，有4 条肽链得到了碎片分布均匀的二级质谱图和解谱序列可信度较高的评分（Peaks软件中推荐序列的分值大于60），最终得到分子质量分别为750.27、726.44、744.42、816.28 Da的肽序列，这4 条呈味多肽的肽序列为Asp-Asp-Cys-Pro-Asp-Lys（DDCPDK）、Leu-Val-Asp-Lys-Pro-Arg（LVDKPR）、Gln-Ala-Asp-Lys-Arg-Lys（QADKRK）、Asp-Thr-Phe-Asn-Asp-Lys（DTFNDK）。这4 条多肽均含有丰富的亲水性氨基酸，这与RP-HPLC分离后推测的结果一致。
4、草菇鲜味肽的呈味特性分析
鲜味肽的感官特性分析
01
如图6A所示，合成后的4 条肽段滋味轮廓基本一致，5种滋味中鲜味和咸味较为突出，具有一定的甜味，苦味最弱。如图6B所示，4种合成肽的鲜味特征突出，其中DDCPDK的鲜味强度最高，其次为DTFNDK，鲜味相对较弱的为LVDKPR。鲜味肽的滋味丰富，往往不止一种味道，其中所有的合成肽均表现出了一定的酸味，这是因为肽链中的羧基解离强度大于氨基，溶液显酸性。
由表2可知，4种合成肽的鲜味阈值存在显著差异（P＜0.05），DDCPDK的鲜味阈值最低，为0.10 mg/mL，说明其鲜味强度最高，QADKRK的鲜味阈值最高，为0.42 mg/mL，说明其鲜味强度最低。同时4种肽表现出不同的增鲜能力，增鲜阈值差异显著（P＜0.05），其中DDCPDK的增鲜阈值最低，在0.02 mg/mL时对0.5 mg/mL味精溶液就能起到明显的增鲜作用，其他3 条鲜味肽的增鲜阈值在0.03～0.18 mg/mL之间，说明这3 条鲜味肽比DDCPDK需要更高浓度达到相同增鲜效果，因此DDCPDK的鲜味增强能力最强。
鲜味肽的呈味效应解析
02
图7A、7B整体趋势相同，这是由于电子舌可以对液体样品的“指纹”信息进行分析，从而对样品进行定性或定量分析。邴芳玲等使用电子舌结合感官评价对食用菌的鲜味强度进行评价，验证了电子舌分析和感官评价具有一致性。图7A与7B均直观反映了鲜味模型中合成肽的释放和消失对模型鲜味的影响。草菇中4种肽的增鲜曲线均呈先升高后降低的趋势，所有合成肽的鲜味峰值质量浓度均为20 mg/mL，当在鲜味峰值浓度时，4种肽的鲜味增强能力差异显著（P＜0.05），其中DDCPDK的鲜味增强能力突出，相比之下DTFNDK的增鲜能力较弱。
如图8所示，4 条合成肽与其等质量配比的氨基酸混合液的呈味特性均存在明显差异。如图8A所示，DDCPDK是以鲜味为主，而混合液则是以甜味为主，其甜味是由天冬氨酸引起；如图8C所示，QADKRK本身以鲜味为主，而混合液以甜味为主，其甜味是由丙氨酸引起；如图8D所示，DTFNDK本身以鲜味为主，而混合液以甜味为主，其甜味是由苏氨酸引起的。DDCPDK、QADKRK以及DTFNDK这3 条合成肽溶液的甜味与鲜味均显著高于其混合液，表明甜味氨基酸（天冬氨酸、丙氨酸、苏氨酸）在与其他氨基酸通过肽键结合后会改变其呈味特性。如图8B所示，LVDKPR是以鲜味为主，而混合液以苦味为主，其苦味是由亮氨酸引起的，合成肽LVDKPR溶液的苦味与鲜味显著高于混合液，表明呈强苦味的亮氨酸在与其他氨基酸通过肽键结合后会改变其呈味特性。因此，研究结果表明这4 条草菇鲜味肽的呈味特性其实并非由单个氨基酸滋味简单叠加而成，而是氨基酸通过肽键形成特定的结构引起。
结 论
依次采用超滤、凝胶过滤色谱和RP-HPLC从草菇水提物中分离纯化出多肽组分F1-a，并基于电子舌分析与感官评价证明其具有较强的鲜味。利用UPLC-Q-TOF-MS进一步鉴定出F1-a组分主要含有DDCPDK、LVDKPR、QADKRK和DTFNDK这4 条短肽。本研究发现鲜味肽的呈味特性是氨基酸通过肽键形成特定的结构引起；从草菇中分离鉴定出的4种短肽既是鲜味肽也是鲜味增强肽，鲜味阈值在0.10～0.42 mg/mL之间，增鲜阈值在0.02～0.18 mg/mL之间，其中短肽DDCPDK对味精溶液的增鲜效果最佳，且最佳添加量为20 mg/mL。研究结果为草菇鲜味调味品的开发提供一定理论依据，以提升草菇附加值。
本文《草菇鲜味肽的分离鉴定及呈味特性分析》来源于《食品科学》2022年43卷12期235-242页，作者：蒋希希，裴斐，赵立艳，马宁，方东路，仲磊，胡秋辉。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20211110-124。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅
图片来源于文章原文及摄图网。
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