吉林农业大学研究生，吉林农业大学研究生院
氧化应激是指机体内氧化失衡的状态，亦是肝损伤发生的主要诱因。氧化应激现象发生时，产生过量的氧自由基会对细胞造成破坏，导致氧化应激损伤。研究表明，活性氧（ROS）是氧正常代谢过程中的产物，也是诱发氧化应激的重要物质，过多的ROS能够影响基因组的稳定性，导致多种慢性疾病发生。
紫萼玉簪又名紫花玉簪，为百合科（Liliacea）玉簪属（Hosta）多年生宿根草本植物，其全草或根均可入药，具有可食用性。目前已有研究证实玉簪中黄酮、皂苷和多糖等成分具有一定的抗炎抑菌活性，但鲜有关于紫萼玉簪根系多糖（HVRP）的抗氧化机制研究。吉林农业大学食品科学与工程学院的吴金姗、刘回民*和吉林农业大学生命科学学院的刘洪章*等旨在探寻HVRP对叔丁基过氧化氢（t-BHP）诱导的HepG2细胞氧化应激损伤的影响，在细胞水平解析HVRP的抗氧化作用机制，为HVRP在功能性食品领域的应用提供理论参考。
1、单因素试验结果
料液比、提取温度和提取时间对多糖提取率的影响如图1所示，当料液比为1∶30时，提取率达到最大；随提取温度的升高，提取率先增加后下降，80 ℃时提取率达到最大；随提取时间延长，提取率先增加后下降，在2 h时提取率最大。当提取温度超过80 ℃、时间超过2 h时，多糖受到持续高温的影响会分解，从而导致提取率降低。
2、响应面优化试验分析结果
响应面试验设计与结果分析
根据表3的结果，利用Design-Expert软件对试验数据进行多元回归拟合，得到二次多项回归模型方程：Y＝24.44+1.21A+0.46B+0.55C+1.35AB-2.77AC+0.78BC-3.15A 2 -0.55B 2 -2.12C 2 。
二次模型回归统计分析结果如表4所示，回归模型高度显著（P＜0.000 1），失拟项P＝0.879 6，决定系数R 2 ＝0.993 4，校正后R 2Adj 表明回归方程的拟合度良好，试验方法有较高可信度，可用该模型来分析和预测多糖的提取条件。由F值可知，各因素对HVRP提取率的影响程度为提取温度＞料液比＞提取时间。
最佳提取工艺的确定及验证
模型分析HVRP最佳提取工艺条件为提取温度83.63 ℃、提取时间2.92 h、料液比1∶30.60，预测提取率24.9%。根据实际情况调整工艺为提取温度84 ℃、提取时间3 h、料液比1∶31，HVRP提取率为23.9%，误差1%，表明该模型可行性较高。
3、HVRP理化性质
经脱脂、脱蛋白处理后HVRP提取率为9.29%。测得HVRP中还原性糖的质量分数为11.17%（111.66 mg/g），蛋白质量分数为0.6%（5.96 mg/g），糖醛酸含量较高，质量分数为12.31%（123.12 mg/g）。研究表明，利用咔唑法测定东北玉簪多糖中的糖醛酸质量分数为20.36%～52.76%；百合多糖中糖醛酸质量分数达12.89%。
4、HVRP结构特征分析结果
由图2A可知，HVRP的红外光谱在3 422 cm -1 处有1 个强吸收峰，是由O—H伸缩振动引起的；2 916 cm -1 处吸收峰为C—H伸缩振动；1 745、1 634、1 446 cm -1 处吸收峰为C＝O对称和不对称拉伸振动引起，表明HVRP中存在糖醛酸，与理化分析结果一致；1 088 cm -1 处的吸收峰为吡喃环的醚键所引起，表明HVRP可能为吡喃糖；813、614 cm -1 处的吸收峰表明其可能含有α型糖。
如图2B所示，随着NaOH浓度增加，HVRP与刚果红试剂作用后的最大吸收波长不断减小，较刚果红未发生红移，最大吸收波长的连续下降可能是因为HVRP在水溶液中为无规卷曲构象，且氢键不断被碱性溶液破坏。由此判断，HVRP不存在三螺旋构象。
5、HVRP的体外抗氧化活性
由图3可知，随HVRP质量浓度增大，其抗氧化活性先升高后趋于稳定，呈一定的剂量效应关系，在HVRP质量浓度为100 μg/mL时，DPPH自由基清除率为63.93%，羟自由基清除率为70.31%，超氧阴离子自由基清除率为83.45%。HVRP表现出较强的体外抗氧化能力，其抗氧化活性可能与HVRP中含有一定的糖醛酸有关。
6、HepG2细胞存活率
采用MTT法检测HVRP的细胞内毒性，如图4A所示，0～100 μg/mL HVRP对HepG2细胞的生长无毒性，当质量浓度为200 μg/mL时，HepG2细胞活力受到抑制。因此，选取5、25、100 μg/mL进行细胞实验。
为了考察HVRP对肝细胞氧化损伤的作用机制，采用t-BHP建立氧化损伤模型。如图4B所示，HepG2细胞活力随t-BHP浓度的增加明显下降。通过GraphPad Prism 7.0软件进行拟合，得到t-BHP作用的半抑制浓度（IC 50 ）为（217.52±20.94）μmol/L。因此，选取浓度220 μmol/L的t-BHP建立细胞氧化损伤模型。
7、HVRP对氧化损伤细胞抗氧化能力的影响
由图5A可知，t-BHP作用于HepG2细胞后，ROS生成量是正常组的4.65 倍。HVRP处理能够极显著降低ROS水平，HV100组ROS水平降低至正常组的1.27 倍。如图5B～F所示，与模型组相比，HVRP能显著或极显著降低MDA含量，显著或极显著提高SOD、CAT和GPx活力并增加GSH含量。以上结果说明HVRP能够通过提高氧化损伤细胞的抗氧化酶活力、降低ROS水平来帮助细胞抵御氧化损伤。
8、HVRP对氧化损伤细胞中Keap1/Nrf2/ARE信号通路基因表达量的影响
由图6可知，与模型组相比，HVRP处理总体上可明显上调氧化应激通路中GST、HO-1、NQO1、JNK、Keap1、Nrf2基因的表达，当HVRP处理质量浓度为25 μg/mL时，以上基因的表达量极显著上调，其中抗氧化信号通路下游基因GST、HO-1、NQO1表达量分别为模型组的4.36、4.67、5.28 倍。
9、HVRP对氧化损伤细胞中Keap1/Nrf2/ARE信号通路蛋白表达量的影响
为进一步验证HVRP的抗氧化作用机制，采用Western Blot检测相关蛋白表达情况，与基因表达结果相似，HVRP组较模型组明显提高了Nrf2/ARE通路下游NQO1、HO-1蛋白表达水平（图7A）。
Nrf2的核转移是诱导NQO1和HO-1表达的关键步骤，HVRP处理使细胞质内Nrf2水平呈剂量依赖型降低趋势，而细胞核内Nrf2水平呈剂量依赖型升高，表明HVRP能促进Nrf2的核转移（图7B）；与模型组相比，HVRP处理提高了Nrf2/ARE通路上游激酶p-JNK/JNK水平（图7C）。上述结果与文献[32]结果相似，提示JNK磷酸化可能会促进Nrf2核转移，从而调控Nrf2/ARE通路下游II期解毒酶NQO1和HO-1的表达。
结 论
本实验优化了HVRP提取工艺，得到最优提取条件为：提取温度84 ℃、提取时间3 h、料液比1∶31，该条件下HVRP提取率为23.9%。体外抗氧化实验表明HVRP具有较强的自由基清除活性。抗氧化机制研究证明了HVRP通过激活氧化应激Keap1/Nrf2/ARE信号通路起到保护HepG2细胞免受t-BHP诱导的氧化损伤作用。综上，本研究可为HVRP作为天然抗氧化剂在功能性食品中的开发应用提供科学依据。
01
通信作者
刘洪章教授，中共党员，博士，吉林农业大学生命科学学院博士生导师，曾任园艺系主任、中药材学院院长、生物技术学院党总支书记、生命科学学院院长。吉林省重点学院和吉林省优势特色重点学科带头人、吉林省优秀教学团队带头人、吉林省特色专业带头人、国家精品视频公开课《长白山特色植物资源》主讲人和吉林省精品课程《生物资源学》主持人、吉林省果树品种审定委员会主任和长春市园艺学会理事长等职。创立了“作物资源学”博士授权学科，主建了吉林农业大学第一个理学一级学科“生物学”硕士授权学科并将其建设成为了吉林省重点学科；主讲本科生课程《生物资源学》和《现代农业与技术概论》和研究生的《生物试验设计与统计分析》及博士生的《作物资源学》和《生物资源多样性及其保护》等课程，主要从事长白山特色园艺植物资源及生物技术研究，主持国家科技部、农业部和吉林省科技厅课题十余项，发表学术论文150余篇，主持选育新品种8个，培养硕士和博士研究生八十余人，主编教材和著作12部；获得吉林省科技进步一、二、三等奖7项和吉林省教学成果二、三等奖5项，被评为吉林省师德先进个人、长春市师德标兵和第七届吉林省高等学校教学名师。
刘回民副教授，中共党员，博士，吉林农业大学食品科学与工程学院硕士生导师。主要从事分子营养和食品化学领域的研究工作，在天然植物活性成分的分离提取、功能研究和递送方面取得了系列创新性成果。主持承担国家十三五重点研发计划子课题、吉林省自然基金项目等国家、省部级项目6项，在 Journal of Agriculture and Food Chemistry, Food Chemistry, Food & Function, Nutrients, Food Control, 食品科学等国内外学术期刊发表论文40余篇，获得省部级科研奖励8项，副主编教材1部。担任 Journal of Agricultural and Food Chemistry, Food Research International, Phytomedicine, Food & Function, Journal of Functional Foods等国际期刊审稿人。
02
第一作者
吴金姗，中共党员，吉林农业大学食品科学与工程学院2020级硕士研究生，研究方向为食品科学与功能性食品。以第一作者身份在 International Journal of Biological Macromolecules（JCR2区）发表SCI论文一篇，多次获得研究生学业奖学金及优秀研究生干部等荣誉称号。
本文《玉簪多糖对细胞氧化应激损伤的保护作用机制》来源于《食品科学》2022年43卷17期138-146页，作者：吴金姗，黄榕，刘树英，刘回民，刘洪章，刘景圣。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20210602-026。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅
图片来源于文章原文及摄图网。
为进一步促进动物源食品科学的发展，带动产业的技术创新，更好的保障人类身体健康和提高生活品质，北京食品科学研究院和中国食品杂志社在宁波和西宁成功召开前两届“动物源食品科学与人类健康国际研讨会”的基础上，将与郑州轻工业大学、河南农业大学、河南工业大学、河南科技学院、许昌学院于 2022年12月3-4日 在河南郑州共同举办“2022年动物源食品科学与人类健康国际研讨会”。欢迎相关专家、学者、企业家参加此次国际研讨会。
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